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NgAgo到底能干什么?韩国科学家最新进展或推进真相?

时间:2017/01/22来源:诗迈医药猎头

?韩国学者Jin-Soo Kim等在BioRxiv上传的文章称,DNA介导的NgAgo蛋白切割的是RNA,而不是DNA。




摘要:

在很多科学家表示不能重复韩春雨NgAgo剪切修饰DNA的工作后,曾经发表来信表示同样无法做到的韩国科学家对NgAgo的进一步研究又有了新的进展。他们在1月20日以预印本的形式公布一篇论文,称NgAgo可以作用于RNA。这一结果有什么意义?其他质疑DNA编辑作用的科学家也看到了NgAgo降低基因表达的作用,但当时只发现不是作用与DNA,不知道是否作用RNA或者蛋白质。而韩国科学家得到RNA是NgAgo作用的靶物。另外,还有其他科学家在寻找作用于DNA的Ago家族的其他同源蛋白。韩春雨的研究在事实上刺激了新的研究。他的研究如何判定?诺维信公司的不肯言明的合作是什么意思?《自然-生物技术》收到什么新的材料、如何判定?还有待事件进一步发展。



DNA介导的NgAgo到底能不能实现基因组编辑?自河北科技大学副教授韩春雨及合作者去年5月率先在《自然-生物技术》Nature Biotechnology报告NgAgo-gDNA系统可能是具有巨大潜力的基因编辑工具以来,科学界关于NgAgo是否真的能够进行基因组编辑的讨论就没有停止过。


1月20日,韩国的学者又报道了一篇关于NgAgo的研究。这篇贴在论文预印本网站BioRxiv的文章“利用NgAgo进行依赖DNA的RNA切割”(DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute)称,DNA介导的NgAgo蛋白切割的是RNA,而不是DNA。




NgAgo蛋白切割的是RNA,而不是DNA?



文章显示,韩国国立首尔大学的Jin-Soo Kim课题组通过体外生化实验,发现NgAgo具有DNA依赖的RNA酶活性,并且他们还发现其与NgAgo结合的DNA(gODNs)序列必须与RNA反向互补,而正义DNA(sense DNA)序列则不能引导NgAgo切割靶RNA。也就是说,与NgAgo结合的DNA序列如果与RNA序列相同,则不能引导NgAgo切割靶RNA。


相反,Jin-Soo Kim等人在这个体外生化体系中没有发现NgAgo有切割DNA的活性,这个结果不同于韩春雨之前发表在《自然-生物技术》的NgAgo具有DNA酶活性的结论。


去年8月8日,韩春雨在向质粒共享信息库Addgene提交的详细实验法方法中,提到的EDTA(二价阳离子螯合剂)可能影响NgAgo活性的问题。在这篇论文中,Kim等提供了体外生化证据,但证明的是二价金属离子对于NgAgo的RNA酶活性(而非DNA酶活性)是必须的。


文章作者还做了进一步的实验,测出了gODNs的长度和序列对NgAgo切割RNA效率的影响。实验表明,gODNs长度低于13个核苷酸(nt)则完全不能介导NgAgo的RNA酶活性,而碱基错配会影响NgAgo的酶活性,特别是第5-14nt(5’-3’方向)的碱基最为关键。这些结果与Cas9的DNA酶活性相似,但有意思的是,作者发现NgAgo可以多次循环催化,而Cas9只能使用一次。


Kim等人在BioRxiv上传的论文目前还没有细胞内的实验结果。


几周前,Jin-Soo Kim将文章提交给某学术期刊评审。“评审过程比预想的要长很多,”在给《知识分子》的回复说,Kim说。这是Kim第一次在bioRxiv上报告他们的工作。“24小时内,我们的文章在推特上被转发大约有50多次。”Kim说。




或可解释关于NgAgo的多个报道



Kim等人的这一研究有什么意义呢?


北京大学生命科学学院研究员魏文胜表示,DNA介导的Argonaute切割RNA的研究之前已有报道,Jin-Soo Kim的这一研究如果得到证实,也不是第一次证实DNA介导切割RNA的Argonaute。


例如,2005年,美国洛克菲勒大学的Tomas Tushcl实验室与Dinshaw J. Patel实验室证实,Ago家族的Aa-Ago具有DNA依赖的RNA内切酶活性,可以在55℃以DNA为介导切割靶RNA。2016年,美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室发现,Mp-Ago在60℃也有以DNA为介导靶向切割RNA的特性。


“只是NgAgo那么受关注,有必要确定它到底能够做什么。”魏文胜说。


之前有多个实验室向《知识分子》表示,可以重复韩春雨论文中使用NgAgo以后GFP荧光衰减的实验,但未能发现基因编辑现象。


2016年11月11日,南通大学刘东实验室和复旦大学王永明实验室在线发表在《细胞研究》Cell Research的研究结果表明,他们设计的NgAgo-gDNA系统并没有在斑马鱼上表现出基因编辑的功能,而是敲低(knock down)对应的基因表达,从而引起斑马鱼眼睛的发育缺陷。


对于以上现象,“我们猜测,NgAgo可能切割的是RNA而不是DNA”,Jin-Soo Kim说。


接下来的研究结果支持了Jin-Soo Kim等人的猜测。Jin-Soo Kim的这篇文章称,他们的实验结果可以解释这些现象,特别是在刘东的论文中发现NgAgo的三个突变体(D663A, D738A, and D663A/D738A)与野生型具有相同的表型,Kim等发现这三个突变体并不能影响NgAgo的酶活性,侧面呼应了刘东等在斑马鱼体内的实验结果。


“Kim今天发表的文章的关键内容,其实我们也预测到了,在我们的《细胞研究》的文章发表之前,我们就曾推测RNA是NgAgo-gDNA系统下调基因的原因之一,但是我们没有拿到直接的证据。”刘东告诉《知识分子》。


刘东等人之前的研究还发现,即使介导DNA与mRNA的序列相同,也是存在基因下调活性的,只是活性比较低。Kim的结果只能解释gODNs与RNA反向互补的情况。不过,这与Kim等人的发现并不矛盾,刘东说,他推测这可能是因为DNA介导的NgAgo还会与靶基因结合,抑制了目标DNA的转录造成的。


“我们的文章发出来以后,也觉得仍然有一些有趣的东西没有研究清楚,所以我们也在进一步探索。”刘东说。




NgAgo基因编辑结果可重复性争议



NgAgo属于被称为Argonaute的一类蛋白质,因为其存在于格氏嗜盐碱杆菌Natronobacterium gregoryi中而得名。这类蛋白质最早在1995年就报道,并发现它们在RNA干扰中发挥重要作用。在韩春雨等人的论文中, NgAgo被认为可以通过以DNA为向导,实现对靶基因的基因编辑。


2016年11月15日,北京大学魏文胜等20位国内外实验室的负责人在学术期刊《蛋白质与细胞》Protein&Cell刊登来信,表示无法重复韩春雨的NgAgo实验结果,对NgAgo能否进行基因组编辑提出疑问。


接下来的11月28日,本文作者Jin-Soo Kim等10位科学家在《自然-生物技术》发表了使用NgAgo无法检测到基因组编辑效果的来信。


去年11月底,《自然-生物技术》表示,针对韩春雨等人NgAgo论文结果的调查将于2017年1月底之前完成,届时将公布最新进展。


今年1月19日,《自然-生物技术》在回应澎湃新闻时表示,期刊获得了与NgAgo系统可重复性相关的新数据,在决定是否采取进一步行动之前,还需要调查研究这些数据。


同一天,河北科技大学官网的一条新闻称,NgAgo-gDNA基因编辑技术工具在诺维信公司的真菌表达系统中已经展现出潜力,诺维信公司与河北科技大学基因编辑技术研究中心在上述技术的合作研发和产业化应用方面签署了合作协议。


据澎湃新闻报道,诺维信表示已经测试了该项技术,“看到了其可能有用的一些迹象,但目前仍处于非常初期的阶段”,还需要大量的工作才能确定该项技术是否适用于他们的业务,但未回应是否重复韩春雨等人发表在《自然-生物技术》的论文结果。


韩春雨未对Kim等人贴在BioRxiv的这篇文章置评。


“到目前为止,还没有证据证明(DNA介导的)NgAgo能够进行基因组编辑,我指的是单链或双链DNA的编辑,切割或修饰。”魏文胜说,对韩春雨等人利用NgAgo-gDNA编辑基因组的文章的质疑仍然存在。


“高(编者注:高峰为《自然-生物技术》发表NgAgo可用于基因组编辑文章的第一作者)等人可能观察到了由于NgAgo的RNA酶活性导致的部分的基因下调。我希望我们的新论文能够终结已有争议,并推动对NgAgo和其它该家族蛋白的新的兴趣点。”Jin-Soo Kim说。

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